默克生命科學實驗方案分享 | 核酸電泳方法 & 簡介

簡介——什麼是電泳?

電泳是根據基質上的凈電荷、大小和構象對核酸(DNA 和 RNA)和蛋白質等大分子進行分離純化的方法。由於磷酸基團的存在,核酸具有整體負電荷。因此,它們向陽極移動的速度完全取決於它們的大小。蛋白質含有整體的正電荷或負電荷;這使得蛋白質分子能夠向一個稱為等電點的 pH 移動,在該等電點分子沒有凈電荷。通過對蛋白質進行變性,並給予它們均勻的電荷,就可以根據大小將它們分開。大分子在由瓊脂糖或聚丙烯酰胺組成的基質或凝膠內電泳。由這些聚合物制成的凝膠含有孔隙,當施加電壓時,蛋白質和核酸可以通過這些孔隙。更多內容到默克sigma試劑官網查看:www.sigmaaldrich.cn

DNA 瓊脂糖凝膠電泳

瓊脂糖是從海藻中提取的多糖,通常以0.5-2%的濃度用於DNA和RNA電泳。它可形成具有合適孔徑的晶格,以便核酸能夠移動到正極。

圖 1.核酸瓊脂糖凝膠電泳

實驗方案:DNA 瓊脂糖凝膠電泳

所需材料和試劑

  • 電泳室,包含電源、灌膠板和點樣梳
  • Bionic™ 緩沖液 (B6185) 或下列其中一種電泳緩沖液:1X TAE (65497) ,包含:0.04 M Tris-醋酸鹽 (pH 7.6)0.001 M EDTA或1X TBE (93290),包含:0.13 M Tris (pH 7.6)45 mM硼酸2.5 mM EDTA
  • 上樣緩沖液 (G7654, G2526) 或在 1X TAE 或 1X TBE 中使用以下材料制備:50% 甘油0.25% 溴酚藍 (B5525)0.25% 二甲苯腈藍 FF (X4126)
  • BlueView™ 核酸染色劑(T9060和T8935 )、SYBR® Green核酸染色劑 (S9430) 或溴化乙錠:在蒸餾水中制備0.5μg/ mL。
  • 透射儀

預制瓊脂糖凝膠

Sigma-Aldrich 可提供加入溴化乙錠的8孔、20孔和24孔預制瓊脂糖凝膠。如果使用預制凝膠,則繼續“凝膠通電”步驟。

也可通過以下步驟自行灌制瓊脂糖凝膠。

瓊脂糖溶液制備

  • 量取適量瓊脂糖粉,加到燒杯或燒瓶中的 1X TAE 緩沖液中。說明:瓊脂糖量取決於所需凝膠的百分比。瓊脂糖溶液的體積必須根據所用凝膠拖盤的大小來制備
  • 在磁性加熱板上加熱溶解瓊脂糖。也可在微波爐中加熱,每分鐘旋轉一次,直到瓊脂糖完全溶解。
  • 當瓊脂糖冷卻至 50-60°C 時,向溶液中加入溴化乙錠(0.5µg/mL 最終濃度)。另一種方法是電泳後將凝膠浸入溴化乙錠溶液中。重要提示: 溴化乙錠是一種致癌劑。處理溴化乙錠時務必佩戴手套和口罩。
  • 瓊脂糖冷卻時,準備好凝膠托盤以進行灌膠,使瓊脂糖溶液在凝固前不會流出。這可以通過使用托盤隔障、Flexicaster或用傳統的實驗室膠帶密封來實現。將梳子置於凹槽中,並將托盤置於平坦的水平位置。
  • 慢慢倒入瓊脂糖溶液,使其均勻地分佈在托盤上,確保沒有氣泡滯留在凝膠中。使凝膠在室溫下固化。
  • 取出梳子,用托盤將凝膠轉移到電泳槽,加入1X電泳緩沖液,直到凝膠剛好被緩沖液覆蓋。

DNA 樣品制備

Sigma-Aldrich 提供 GenElute™ 試劑盒,用於從植物和真菌 ( E5038 )、哺乳動物細胞或組織 (G1N70, G1N10 and G1N35) 、以及血液(NA2010 和 NA2020)中分離 DNA。

為保護分離的 DNA 不被降解,建議將 DNA 溶解在 TE 緩沖液中 ( T9285 )。

此外,DNAstable® 試劑盒 (93000-001-1EA, 93021-001-1EA, 53091-016-2ML 和 93121-017-1EA)可用於DNA運輸或確保DNA在室溫下的儲存和穩定。

  • 按標準方法從細胞或組織中分離 DNA。
  • 用溴化乙錠染色時,在瓊脂糖凝膠上檢出所需的最低 DNA 濃度為 2 ng。
  • 將核酸樣品與 10X 上樣緩沖液混合。一般情況下,3 μL 上樣緩沖液就足夠瞭,但少於 10 μL 的樣品可使用更少的量。

凝膠電泳

  • 使用移液器將樣品小心地加入孔中。也可加入含有各種大小核酸片段的適當標記物(D7058, D3937, D3812)。
  • 蓋上電泳槽蓋子並連接電源。樣品在瓊脂糖凝膠中電泳的常用電壓為 90-150v。
  • 應使用橙色 G ( O3756 )、溴酚藍 ( B8026 ) 或二甲苯靛藍 ( x4126 ) 追蹤染料前沿。

凝膠濃度 (% w/v)有效分離范圍 (bp)二甲苯腈藍 (bp)溴酚藍

凝膠染色和觀察

摻入溴化乙錠的凝膠:

  • 電泳後,將凝膠轉移至紫外透射儀,並獲取凝膠圖像。
  • 樣品將顯示為亮帶。

未摻入溴化乙錠的凝膠:

  • 將電泳後的凝膠轉移至SYBR® Green核酸染色劑(1:10,000 稀釋,避光染色)或 0.5µg/ml 溴化乙錠染色溶液中 15-30 分鐘。
  • 如果使用 SYBR® Green 核酸染色劑,則可在染色後立即獲取凝膠圖像。
  • 如果使用溴化乙錠,將凝膠置於蒸餾水中 10-30 分鐘,確保凝膠完全浸入水中。
  • 將凝膠轉移至紫外透射儀並獲取凝膠圖像。
  • 樣品將顯示為亮帶。

瓊脂糖凝膠熒光染色

Sigma-Aldrich可提供 Nancy-520 (01494),這是一種可用於替代溴化乙錠的熒光染色劑。它是一種更安全、更穩定、更環保的溴化乙錠替代品。Nancy-520 的激發波長為 520 nm,發射波長為 560 nm。

摻入Nancy-520 的凝膠:

  • 灌膠時可將 Nancy-520 摻入瓊脂糖中(10 μL 至 50 mL 瓊脂糖)。
  • 電泳後,獲取凝膠的熒光圖像。

未摻入 Nancy-520 的凝膠:

  • 加入 10 μL Nancy-520 至 50 mL 1X TBE 緩沖液制備染色液。
  • 電泳結束後,將凝膠浸入染色液中,並在搖床上避光保存 1小時。
  • 用 1X TBE 緩沖液沖洗凝膠 10-30 秒。
  • 拍攝凝膠的熒光圖像。

圖 2.水平電泳系統

RNA 瓊脂糖凝膠電泳

瓊脂糖凝膠電泳可以根據RNA的大小和完整性來評估RNA的質量。然而,由於廣泛的分子內堿基配對幹擾瞭瓊脂糖凝膠上基於大小的遷移,RNA形成瞭各種二級結構。因此,RNA 分子必須使用甲酰胺和甲醛進行變性。

實驗方案:RNA 瓊脂糖凝膠電泳

所需材料和試劑

確保所有使用的設備都不含RNAses,所有使用的緩沖液都采用無RNAses的水配制。

  • 電泳室,包含電源、灌膠板和點樣梳
  • 1X MOPS-EDTA-乙酸鈉 (MESA) 緩沖液 (M5755):40 mM MOPS10 mM 乙酸鈉1 mM EDTA (pH 8.3)
  • RNA樣品緩沖液(R1386 和 R4268)62.5% (v/v) 去離子甲酰胺1.14 M 甲醛1.25X MESA緩沖液200 µg/mL溴酚藍 (B2225)200 µg/ml 二甲苯腈藍FF ( X4126 )

Sigma-Aldrich可提供含/不含溴化乙錠的RNA 樣本緩沖液(R1386/R4268)

  • SYBR® Green核酸染色劑 (S9430) 或溴化乙錠:0.5μg/ mL 蒸餾水溶液
  • 透射儀

預制瓊脂糖凝膠

Sigma-Aldrich可提供 8 孔 RNA預制1.25% 瓊脂糖凝膠 (P6222)。這種預制凝膠不含溴化乙錠。如果使用預制凝膠,則繼續“凝膠通電”步驟。

也可通過以下步驟自行灌制瓊脂糖凝膠。

瓊脂糖溶液制備

  • 量取適量瓊脂糖粉,加到燒杯或燒瓶中的 1X MESA 緩沖液中。說明:瓊脂糖量取決於所需凝膠的百分比。瓊脂糖溶液的體積必須根據所用凝膠拖盤的大小來制備
  • 在磁性加熱板上加熱溶解瓊脂糖。也可在微波爐中加熱,每分鐘旋轉一次,直到瓊脂糖完全溶解。
  • 當瓊脂糖冷卻至 50-60°C 時,向溶液中加入溴化乙錠(0.5µg/mL 最終濃度)。另一種方法是電泳後將凝膠浸入溴化乙錠溶液中。重要提示: 溴化乙錠是一種致癌劑。處理溴化乙錠時務必佩戴手套和口罩。
  • 瓊脂糖冷卻時,準備好凝膠托盤以進行灌膠,使瓊脂糖溶液在凝固前不會流出。這可以通過使用托盤隔障、Flexicaster或用傳統的實驗室膠帶密封來實現。將梳子置於凹槽中,並將托盤置於平坦的水平位置。
  • 慢慢倒入瓊脂糖溶液,使其均勻地分佈在托盤上,確保沒有氣泡滯留在凝膠中。使凝膠在室溫下固化。
  • 取出梳子,用托盤將凝膠轉移到電泳槽,加入1X電泳緩沖液,直到凝膠剛好被緩沖液覆蓋。

RNA 樣品制備

  • 哺乳動物細胞或組織(RTN70, RTN10 和 RTN350)可使用TRI Reagent® (T9424)或 GenElute™ 試劑盒從細胞或組織樣品中分離 RNA
  • 為瞭確定 RNA 的質量和濃度,分別在 260 nm 和 280 nm 處讀取樣品的吸光度。吸光度比值A260/A280為 1.8-2.1 表示 RNA的質量較好。為瞭通過瓊脂糖電泳法進行有效檢測,至少需要 5 μg 的 RNA。
  • 將 1 體積的 RNA 樣品與 2-5 體積的樣品緩沖液混合。
  • 將樣品加熱至 65°C 10 分鐘,並立即在冰上冷卻,以防止 RNA 分子復性。

凝膠電泳

  • 使用移液器將樣品小心地加入孔中。如果需要,也可加入含有各種大小 RNA 片段(R7020, R7644)的適當標記物。
  • 蓋上電泳槽蓋子並連接電源。樣品在瓊脂糖凝膠中電泳的常用電壓為 90-150v。
  • 應使用 Pyronin Y ( P9172 )、溴酚藍 ( B8026 ) 或二甲苯靛藍 ( x4126 ) 跟蹤染料前沿。

凝膠濃度 (% w/v)有效分離范圍 (bp)二甲苯腈藍 (bp)溴酚藍

凝膠染色和觀察

摻入溴化乙錠的凝膠:

  • 電泳後,將凝膠轉移至紫外透射儀,並獲取凝膠圖像。
  • 樣品將顯示為亮帶。

未摻入溴化乙錠的凝膠:

  • 在無RNase的蒸餾水中輕輕洗滌凝膠 10 分鐘以除去甲醛。
  • 電泳後將凝膠轉移至SYBR® Green 核酸染色劑 (1:10,000) 或 0.5µg/ml 溴化乙錠染色溶液中 15-30 分鐘。
  • 如果使用 SYBR® Green 核酸染色劑,則可在染色後立即獲取凝膠圖像。
  • 如果使用溴化乙錠,將凝膠置於蒸餾水中 10-30 分鐘,確保凝膠完全浸入水中。
  • 將凝膠轉移至紫外透射儀並獲取凝膠圖像。
  • 樣品將顯示為亮帶。

聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺和雙丙烯酰胺(N,N'-亞甲基雙丙烯酰胺)反應形成高度交聯的凝膠基質。丙烯酰胺凝膠可以分離長度相差僅 0.2% 的 DNA 片段。雖然蛋白質在聚丙烯酰胺上分離前必須經過SDS變性,但帶負電荷的DNA分子不需要變性。與瓊脂糖凝膠相比,聚丙烯酰胺凝膠可以容納更大量的樣品,並提供高分辨率的 DNA 片段。

盡管DNA的預制PAGE凝膠被廣泛使用,但如果PAGE是實驗室的常規程序,那麼成本就很高。熟練的技術人員可以以預制凝膠的僅一小部分成本輕松制備 PAGE 凝膠。內部制備的 PAGE 凝膠可提供更好的分辨率,並有助於獲得一致的結果。

實驗方案:DNA 聚丙烯酰胺凝膠電泳

所需材料和試劑

包含電源、玻璃板、墊片和點樣梳的垂直電泳室

  • 30% 聚丙烯酰胺溶液(0.45 mM 濾膜過濾,4℃ 避光保存):29 g 丙烯酰胺1 g 雙丙烯酰胺100 mL 雙蒸水
  • 10% 過硫酸銨溶液
  • TEMED
  • 電泳緩沖液:1X TBE 蒸餾水溶液:89 mM Tris (pH 7.6)89 mM硼酸2 mM EDTA
  • 5X 凝膠上樣緩沖液:80% 甘油 75%溴酚藍 (B5525) 0.25%二甲苯腈藍 (X4126) 0.25%1M Tris (pH 7.4) 10 mM5 M NaCl 10 mM0.5 M EDTA 10 mM10% SDS 0.1%
  • 溴化乙錠 0.5µg/ml
  • 透射儀重要提示:丙烯酰胺和雙丙烯酰胺在性質上具有神經毒性。所有步驟均應佩戴無粉手套進行。

操作流程

  • 用去離子水和乙醇清潔凝膠澆註裝置的玻璃板和墊片。
  • 將玻璃板和墊片組裝在穩定的表面上。
  • 根據所需凝膠的百分比,使用以下體積制備凝膠溶液(制成體積為12 mL)。

* TEMED必須最後添加。

  • 將凝膠溶液倒入組裝瞭墊片的玻璃板中。立即插入點樣梳,確保凝膠中或梳齒周圍沒有氣泡。將凝膠在室溫下放置約 30-60 分鐘聚合凝膠可用保鮮膜包裹並儲存在 4°C 條件下,以備將來使用。
  • 準備進行電泳時,將凝膠板安裝在儀器上,用1X TBE緩沖液填充電泳室。建議在5v /cm下預運行約10分鐘。
  • 通過將 1 μL 樣品與 5μl 5x 凝膠上樣緩沖液混合來制備寡核苷酸樣品。小心地將樣品加入孔中,不得產生任何氣泡。
  • 大型凝膠可以約70 V電泳14-16 小時或 125-150 V電泳2-4 小時,或直到染料前沿接近凝膠底部。確保凝膠不會過熱。也可讓樣品在冷室中進行更高電壓的電泳。
  • 用刮刀撬開玻璃板,把上面的玻璃板分開。用 0.5μG/mL 溴化乙錠溶液給凝膠染色,同時仍然將其附著在下玻璃板上 5-10 分鐘。
  • 將玻璃板上的凝膠浸泡在蒸餾水中 10-30 分鐘,去除多餘的染色並降低背景染色。
  • 用保鮮膜包裹凝膠和凝膠板,倒轉置於紫外透射儀上並獲取凝膠圖像。
  • 樣品將顯示為亮帶。
  • 所需條帶可用精細的手術刀切割並適當處理,以便回收 DNA。

如果在寡核苷酸中加入35S或33P核苷酸,請遵循以下步驟:

  • 將凝膠在 10% 乙酸中浸泡 15 分鐘。
  • 將凝膠拍幹,用保鮮膜包裹。
  • 在 80°C 真空幹燥器中幹燥凝膠 20 分鐘或更長時間。
  • 去除保鮮膜,在暗室將凝膠暴露於 X 光膠片中。

圖 3.垂直電泳系統

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