酶切位點,保護堿基,kozak序列,這些引物設計要素你掌握瞭麼

首先,限制性酶切位點就不用多說瞭吧,它就是DNA分子上被特異性的核苷酸序列(4-8bp),能被限制性內切酶識別,從而切割。

保護堿基:限制性內切酶識別特定的DNA序列,除此之外,酶蛋白還要占據識別位點兩邊的若幹個堿基,這些堿基對內切酶穩定的結合到DNA雙鏈並發揮切割DNA作用是有很大影響的,被稱為保護堿基。【百度百科】

Kozak序列:KOZAK是一個女科學傢,她研究過起始密碼子AUG周邊堿基定點突變後對轉錄和翻譯所造成的影響,並總結出在真核生物中,起始密碼子兩端序列為:—— G/N-C/N-C/N-ANNAUGG——,如GCCACCAUGG、GCCAUGAUGG時,轉錄和翻譯效率最高,特別是-3位的A對翻譯效率非常重要。該序列被後人稱為Kozak序列,並被應用於表達載體的構建中。

所以,引物設計上遊引物就是在起始密碼子前面5‘-保護堿基+酶切位點+Kozak+ATG+一小段目的基因序列

下遊引物不用加Kozak序列,通常是5‘-保護堿基+酶切位點+終止密碼子+(如果你有要表達的標簽序列)+一小段目的基因序列

註意,我這裡的介紹的引物設計針對目的基因要表達的,pcr出來後是要連接到表達載體上的,所以引物比較長,一般都有40多bp瞭,不過一樣能夠p出來。

好瞭,下面隨便找一個基因為例來實戰一下,比如我要將Stat5a從一個公司給的質粒上p出來,然後連接到一個表達載體上,采用直接雙酶切目的基因和表達載體,然後連接的方式。在UCSC上找到Stat5a的CDs區。

從起始密碼子ATG到終止密碼子TGA復制到一個word裡,

接下來用DNAMAN看這段CDs區裡面存在哪些酶切位點,然後根據你表達載體多克隆位點存在哪些酶切位點,選擇兩個在表達載體多克隆位點有但是CDs區裡面沒有的兩個酶切位點進行設計。不然內切酶把你的目的基因切斷瞭就玩不下去瞭。。。。。

假設我以BamH1、Sal1分別作為上下遊的酶切位點

好瞭,現在去百度找酶切位點保護堿基

百度文庫很多這樣的表,找到BamH1、Sal1,註意該表格後兩列表示酶切2h、20h的酶切效率,當然是選最高的那個最好。

百度文庫很多這樣的表,找到BamH1、Sal1,註意該表格後兩列表示酶切2h、20h的酶切效率,當然是選最高的那個最好。

上遊:CGCGGATCCGCCACCATGGCGGGCTGGATTCAGGC

下遊(特別註意要你設計出來的要反向互補):GCGTCGACTCAGGACAGGGAGCTTCTA

好瞭,引物就這樣設計好瞭,很簡單有沒有~~~

??用DNAMAN怎麼找酶切位點,下次再說~~~

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