幹貨:流式細胞術簡介 | 流式專題

摘要:

流式細胞術是一種可對溶液中的單個細胞進行快速篩選和分析的技術。流式細胞儀利用激光作為光源產生散射光和熒光信號,這些信號由光電二極管或光電倍增管等檢測器讀取。這些信號被轉換成電子信號,標準化格式 (.fcs) 數據文件輸出。特定的細胞亞群可以基於它們的熒光或光散射特性進行分析並進行分離純化。

在流式細胞術中可使用多種熒光試劑。這些包括熒光偶聯抗體、DNA結合染料、活力染料、離子指示劑染料和熒光蛋白。

流式細胞術是一種強大的工具,可應用於免疫學、分子生物學、細菌學、病毒學、癌癥生物學和傳染病監測,為免疫系統和其他細胞生物學領域的研究提供瞭前所未有的細節和分辨率。

在單細胞測序時代,流式細胞儀仍然將發揮其巨大作用。

1 前言

當單個細胞或顆粒物懸浮在緩沖液中時,流式細胞術可通過單個或多個激光器對這些細胞進行分析。分析每個粒子的可見光散射(visible light scatter)和一個或多個熒光參數。

可見光散射在兩個不同的方向上進行測量,橫坐標的前向散射光(FSC)可反應細胞的相對大小,而縱坐標的側向散射光(SSC)則反映細胞內顆粒的大小和多少。

所以坐標圖上每一點同時表示具有相應坐標值的細胞存在。光散射與熒光無關。

通過熒光蛋白(如GFP)的轉染和表達、用熒光染料(例如碘化丙啶)染色或用熒光偶聯抗體(例如CD3 FITC)染色來制備用於熒光測量的樣品。

流式細胞術可應用於免疫學、病毒學、分子生物學、癌癥生物學和傳染病監測等多個學科。例如,它對於研究免疫系統、傳染病和癌癥等非常有效。它允許同時標記來自血液和骨髓的混合細胞群以及可以分離成單個細胞的實體組織,如淋巴結、脾臟、粘膜組織、實體瘤等。除瞭細胞亞群的分析,流式細胞術的一個主要應用是分選細胞以進行進一步分析。

用於流式細胞術的儀器在過去幾十年中不斷發展。多激光系統和專為特定目的而設計的儀器都很常見,後面會進行詳細介紹。

過去幾年中可用試劑的增加導致流式細胞術實驗中使用的參數數量爆炸式增長。用於偶聯單克隆抗體的熒光染料顯著增加。

此外除瞭GFP,用於轉染的熒光蛋白也有所增加,例如mCherry、mBanana、mOrange、mNeptune 等。熒光染料和儀器的這些進步使得在實際應用過程中的參數超過瞭30個。

流式細胞術實驗的最後一部分是數據分析。傳統的二參數直方圖設門(gate)和分析仍然被頻繁使用。然而,參數數量和實驗復雜性的增加使得新的分析算法開始湧現,如PCA、SPADE和tSNE等。

2. 流式細胞儀分類

2.1傳統流式細胞儀

傳統的流式細胞儀由三個系統組成:流動室和液流系統、激光源和光學系統、光電管和檢測系統。

射流系統由鞘液(通常是緩沖鹽水溶液)組成,施加壓力後將樣品輸送並聚焦到激光檢測器處並分析樣品。

光學系統由激發光學器件(激光器)和收集光學器件(光電倍增管、PMT和光電二極管)組成,它們產生用於分析樣品的可見光和熒光信號。

二向色濾光片(dichroic filters)將熒光引導至特定的檢測器,帶通濾波器(bandpass filters)確定讀取的光波長,以便檢測和測量每個單獨的熒光染料。進一步來說,二向色濾光片是使波長較短或較長的光通過並以一定角度反射剩餘光的濾光片。

例如,450二向色長通濾光片(DLP)讓波長>50 nm的光通過濾光片,並以一定角度反射較短波長的光,然後將其發送到另一個檢測器。帶通濾波器檢測特定波長的光的小窗口。例如,450/50帶通濾波器使波長為450 nm +/- 25 nm 的熒光通過濾光片,由檢測器讀取。

電子系統將來自探測器的信號轉換為可由計算機讀取的數字信號。450二向色長通濾光片(DLP)讓波長超過450nm的光通過濾光片,並以一定角度反射較短波長的光,然後將其發送到另一個檢測器。帶通濾波器檢測特定波長的光的小窗口。例如,450/50帶通濾光片使波長為450 nm +/- 25 nm 的熒光通過濾光片,由檢測器讀取。電子系統將來自探測器的信號轉換為可由計算機讀取的數字信號。

450二向色長通濾光片(DLP) 讓波長超過 450 nm 的光通過濾光片,並以一定角度反射較短波長的光,然後將其發送到另一個檢測器。帶通濾波器檢測特定波長的光的小窗口。例如,450/50 帶通濾光片使波長為 450 nm +/- 25 nm 的熒光通過濾光片,由檢測器讀取。電子系統將來自探測器的信號轉換為可由計算機讀取的數字信號。

多激光系統對於通常具有20個參數的儀器(FSC、SSC和18個熒光檢測器)很常見。有新的儀器平臺引入瞭五個或更多激光器和30-50個參數,但這些不太常見。

傳統流式細胞儀中最常用的激光有488nm(藍色)、405nm(紫色)、532nm(綠色)、552 nm(綠色)、561nm(綠黃色)、640nm(紅色)和355 nm(紫外線),額外的激光波長可用於特殊應用。

此外,還有一些儀器用雪崩光電二極管(APD)代替瞭PMT,用於熒光檢測,目的是提高靈敏度。

2.2聲聚焦流式細胞儀(Acoustic Focusing Cytometers)

該流式細胞儀使用超聲波能夠更好地聚焦細胞以進行激光檢測。這種類型的聲聚焦流式細胞儀允許更大的樣本輸入的細胞起始量,樣本發生堵塞的概率也更小。該流式細胞儀最多可使用4個激光和14個熒光通道。

2.3細胞分選儀(Cell Sorters)

一種特定類型的傳統流式細胞儀是細胞分選儀,它可以純化和收集樣品以供進一步分析。細胞分選器允許用戶設門(Gate)對所需參數為正(或負)的細胞或顆粒群,然後將這些細胞引導到收集容器中。細胞分選機通過高頻振蕩液體樣本流以產生液滴來分離細胞。然後液滴被賦予正電荷或負電荷,並通過金屬偏轉板,在那裡它們根據其電荷被引導到特定的收集容器。收集容器可以是離心管、載玻片或96孔板/384孔板。有兩種類型的細胞分選儀,石英比色皿和“空氣激發/噴射”(jet-in-air),它們的不同之處在於激光檢測點的位置。石英比色皿細胞分選儀具有固定的激光對準,更容易為分選做好準備。“空氣激發/噴射”細胞分選儀需要每天校準激光,設置起來更困難,但更適合小顆粒檢測。

2.4成像細胞儀(Imaging Cytometers)

成像流式細胞儀(IFC)將傳統流式細胞術與熒光顯微鏡相結合。允許在單個細胞和群體水平上快速分析樣品的形態和多參數熒光(Barteneva et al., 2012)。

IFC可以跟共聚焦顯微鏡或熒光顯微鏡一樣跟蹤單個細胞內的蛋白質分佈,也可以像流式細胞儀一樣處理大量細胞。

它們在多種應用場景如細胞信號傳導、共定位、細胞間相作、DNA損傷和修復以及需要能夠協調細胞定位與大量細胞上的熒光表達等。

2.5質譜流式細胞儀(Mass Cytometers)

質譜流式細胞儀結合瞭飛行時間質譜儀和流式細胞儀。細胞用重金屬離子標記抗體(通常來自鑭系元素系列)而不是熒光標記抗體進行標記,並使用飛行時間質譜法進行檢測。質譜流式細胞儀不具備FSC或SSC光檢測功能,因此無法使用常規方法檢測細胞聚集體。

此外,質譜流式細胞術沒有細胞自發熒光信號,試劑沒有與熒光標記相關的發射光譜重疊,因此不需要補償。

然而,樣品在分析過程中會被破壞,因此無法進行細胞分選,並且采集速率遠低於標準流式細胞儀。

目前有40個通道的試劑,但隨著引入其他金屬離子(如鉑)與抗體結合,這個數字將會增加(Mei et al., 2016)。

2.6用於微珠矩陣分析的細胞儀(Cytometers for Bead Array Analysis)

多重微珠陣列利用在特定通道中具有已知熒光量的捕獲微珠和由單獨激光檢測的報告分子來量化與特定微珠相關聯的捕獲分析物的量,相當於100次ELISA檢測。已開發瞭通常帶有2個激光器和96孔裝載器的小型流式細胞儀來分析這些測定。這些儀器占地面積小,光學平臺設計經過優化,可檢測和區分沿兩個通道具有不同熒光量的珠子。已開發出可檢測100-500種不同微珠組合的儀器。2.7光譜分析儀(Spectral Analyzers)

多參數流式細胞術的挑戰之一是熒光染料之間的補償(或消除光譜重疊)。

光譜分析儀是一種新型流式細胞儀,專為解決這一問題而設計。光譜分析儀測量多色樣品中每種熒光染料的整個熒光發射光譜。然後在分析過程中,將每個光譜分開,為每個熒光染料提供純信號(Sony, 2017)。光譜分析開始取代傳統的PMT作為高維流式細胞術的檢測方法。

3. 可用試劑

3.1有機小分子

luoroscein (MW=389 D)、Alexa Fluor 488 (fluorescein analog)、Texas Red (325 D)、Alexa Fluor 647 (1464 D)、Pacific Blue和Cy5 (762 D)等小分子通常用於抗體偶聯。

它們具有一致的發射光譜,但斯托克斯位移很小(激發波長和發射波長之間的差異,大約50-10 nm)。它們也很穩定,很容易與抗體偶聯。

3.2藻膽蛋白(Phycobiliproteins)

藻膽蛋白是來自藍藻、鞭毛藻和藻類的大蛋白質分子。它們是大分子,例如藻紅蛋白的分子量為240,000 D。

這些蛋白質具有大的斯托克斯位移(75-200 nm),並且非常穩定,具有一致的發射光譜。

由於它們的大尺寸,藻膽蛋白非常適合定量流式細胞術,因為它們在綴合過程中通常具有 1:1 的蛋白質與熒光染料的比率。

然而,藻膽蛋白易受光漂白影響,不推薦用於長時間或反復暴露於激發源的應用。藻膽蛋白的例子是藻紅蛋白 (PE)、別藻藍蛋白 (APC) 和 peridinin 葉綠素蛋白 (PerCP)。

3.3量子點(Quantum Dots)

量子點是半導體納米晶體,具有與納米晶體尺寸相關的緊密熒光發射光譜。

它們最適合用紫外或紫光激光激發,但也可能被多個激光最低限度地激發。當量子點用於多參數實驗時,這種最小激發使熒光補償復雜化。

由於補償問題和將量子點與抗體結合的困難,這些試劑在多參數染色面板中已在很大程度上被聚合物染料取代。

3.4高分子染料

聚合物染料由收集光信號的聚合物鏈組成,可以根據聚合物鏈的長度和連接的分子亞基“調整”以吸收和發射特定波長的光。

這些染料非常穩定,具有與藻膽蛋白相似的量子效率,但光穩定性大大提高。

由於可以使聚合物染料僅吸收特定波長的光,因此它們避免瞭多次激光激發導致量子點試劑難以在多參數實驗中使用的問題。這些試劑的例子是亮紫(BV)、亮紫外(BUV)和亮藍(BB)試劑。

3.5串聯染料

串聯染料將藻膽蛋白(PE、APC、PerCP)或聚合物染料(BV421、BUV395)與小的有機熒光染料(Cy3、Cy5、Cy7)化學偶聯,以產生一種染料,該染料使用熒光能量轉移(fluorescence energy transfer, FRET)來增加可用的熒光染料可以用單個激光源激發。

例如,德克薩斯紅TxRed的最大激發波長為589nm,PE的波長為585nm,因此通過將PE耦合到TxRed,PE的發射光用於FRET激發TxRed,從而允許PE-TxRed被激發488nm或532nm激光。

聚合物鏈抗體使用相同的方法來增加可由單個激光激發的可用熒光染料。

串聯染料非常明亮,具有較大的斯托克斯位移值(150–300 nm),這在處理低抗原密度時非常有用。然而,串聯染料不如供體熒光染料穩定,並且能量轉移效率有批次效應,使補償復雜化。。

3.6核酸染料

核酸染料結合 DNA、RNA或兩者。它們用於定量DNA以進行細胞周期分析(碘化丙啶、7AAD、DyeCycle Violet、DAPI)、區分染色體進行分選(Hoescht 33342、Chromomycin A3)、使用側群分析(Hoescht 33342)分選幹細胞、細胞活力和分揀細菌。

它們可以與另一種標記物溴脫氧尿苷(BrdU)結合來確定細胞增殖現象。

3.7 增殖染料

可以通過用溴脫氧尿苷(BrdU)脈沖細胞,然後用抗Brd 的抗體和DNA染料染色來測量細胞增殖。

然而,這種方法不允許進行長期增殖研究。羧基熒光素琥珀酰亞胺酯(CFSE)和其他類似染料可用於跟蹤增殖細胞的多次分裂。

這些染料的紅色和紫色激發變體現在也可用。每個細胞都被染料永久標記,由於染料的稀釋,隨後的細胞繼承瞭較少量的染料。這些染料不影響細胞生長或形態,適用於長期增殖研究。

3.8細胞活力染料

細胞活力可以通過染料(碘化丙啶,DAPI)或通過染料與細胞內的胺結合來確定細胞膜是否完整來測量。

例如Thermo Fisher的Live/Dead試劑、Zombie染料 (Biolegend)或可固定活力染料Fixable Viablity(BD)等,可以跟細胞內外的胺共價結合,將染色結果在甲醛固定後保留。

通常單細胞核測序中,部分細胞核質量不高或有很多碎片混在測序數據中會導致後期可用數據分析質量較差,若使用流式細胞儀對這些細胞核染色後過濾,則會大大提高後期分析的數據質量。

3.9鈣指示染料

鈣指示劑染料在與鈣結合後會發生顏色變化。它們用於指示細胞激活和信號傳導。數據表示為與結合和未結合的鈣和染料相關的兩個波長的比率。

最常用的染料仍然是 indo-1,一種紫外線雙相鈣探針。還提供包括fluo-3 在內的藍綠色鈣探針。

4. 應用場景

4.1 免疫學

4.1.1 免疫表型

免疫表型分析是流式細胞術中最常用的應用。它利用流式細胞術的獨特能力同時分析混合細胞群的多個參數。

在最簡單的形式中,免疫表型實驗包括用熒光染料偶聯抗體染色的細胞,這些抗體針對細胞表面的抗原。

大多數這些抗原被標記為CD+數字的形式,以便定義針對特定細胞抗原的單克隆抗體。大多數免疫細胞具有特定的CD標記物,將它們定義為一個細胞亞群。

這些細胞標記稱為譜系標記,用於定義特定細胞群,以便在每個免疫表型實驗中進行額外分析。例如T細胞標記(CD3、CD4、CD8)、B細胞標記(CD19、CD20)、單核細胞標記(CD14、CD11b)和NK細胞標記(CD56、CD161)。

除瞭定義細胞群的譜系標記外,還使用其他標記來表征每個細胞群。這些標記可以包括激活標記(CD69、CD25、CD62L)、記憶標記(CD45RO、CD27)、組織歸巢標記(α4/β7)和趨化因子受體標記(CCR7、CCR5、CXCR4、CCR6)。

通常,免疫表型實驗還包括細胞內標記物,例如FoxP3(Treg細胞)、細胞因子(IFN-γ、TNF-α、IL-2定義Th1 細胞)、增殖標記物(Ki67、CFSE)和抗原特異性標記物(主要組織相容性或MHC四聚體)。

4.1.2 抗原特異性反應

通過用特定抗原刺激細胞,然後通過MHC多聚體尋找細胞因子的產生、增殖、激活、記憶或抗原識別,可以測量抗原特異性反應。MHC多聚體是MHC單體(MHC-I 或 MHC-II),它們通常被生物素螯合,然後以四聚體、五聚體或十聚體形式與熒光鏈黴親和素骨架結合。這些MHC多聚體“裝載”瞭選擇的抗原,然後用於與識別抗原的T細胞結合,從而表明對特定抗原的反應水平。這類通常用於疫苗研究。

4.1.3 細胞內細胞因子分析

細胞內細胞因子分析是通過用蛋白質轉運抑制劑(Brefeldin A或Monensin)處理細胞2-12h來進行的,這樣細胞產生的任何細胞因子都可以在細胞內積聚,從而實現更好的檢測。

在此孵育過程中,可以用各種抗原刺激細胞,例如來自疫苗的肽以測量免疫反應。在蛋白質轉運抑制劑處理後,對細胞進行活力標記和細胞表面標記染色,然後固定和透化以使用抗細胞因子抗體進行細胞內染色。

4.1.4 細胞增殖分析

細胞增殖可以通過流式細胞術使用幾種不同的測定和標記來測量。

這些測定使用不同的方法來靶向增殖相關事件,例如將胸苷類似物 (BrdU)納入復制 DNA、可遺傳永久性染料(CFSE) 的世代跟蹤以及增殖相關抗原(Ki67、PCNA)的表達。

增殖相關抗原的表達也可用作增殖的標志物。Ki67 在細胞增殖(所有階段)期間表達,但不在細胞靜止期間表達。

DNA復制需要PCNA(增殖細胞核抗原)。Ki67 或 PCNA 的存在是細胞增殖的指標。

4.1.5 細胞凋亡分析

細胞凋亡或程序性細胞死亡是免疫學和其他研究領域經常檢查的一種現象。它用於通過去除細胞而不觸發炎癥反應(壞死)來維持免疫系統的穩態。

這是免疫反應後克隆擴增的T細胞、自我靶向T細胞、自身反應性B細胞和免疫系統中的多個其他細胞的死亡機制。

通過流式細胞術檢測細胞凋亡,利用與凋亡相關的偶聯抗體多個目標。

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