分子生物學實驗之PCR

分子生物學實驗之PCR

DNA的半保留復制是生物進化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解旋成單鏈,在DNA聚合酶的參與下,根據堿基互補配對原則復制成同樣的兩分子拷貝。在實驗中發現,DNA在高溫時也可以發生變性解鏈,當溫度降低後又可以復性成為雙鏈。因此,通過溫度變化控制DNA的變性和復性,加入設計引物,DNA聚合酶,dNTP就可以完成特定基因的體外復制。

PCR

(Polymerase Chain Reaction)

聚合酶鏈反應簡稱PCR,是以DNA半保留復制機制為基礎,發展出的體外酶促合成、擴增特定核酸片段的一種方法。PCR最大的特點是能將微量的DNA大幅增加。PCR是利用DNA在體外攝氏95°高溫時變性會變成單鏈,低溫(經常是60°C左右)時引物與單鏈按堿基互補配對的原則結合,再調溫度至DNA聚合酶最適反應溫度(72°C左右),DNA聚合酶沿著磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互補鏈。基於聚合酶制造的PCR儀實際就是一個溫控設備,能在變性溫度,復性溫度,延伸溫度之間很好地進行控制。

DNA復制的所需條件

1、模板和底物

DNA復制是模板依賴性的,必須以親代DNA鏈作為模板,親代DNA的兩股鏈解開後,可分別作為模板進行復制。同時,DNA復制需要以四種脫氧核糖核苷酸,即dATP、dGTP、dCTP、dTTP,為底物合成子代DNA。

在體外進行DNA復制時,模板和底物均可通過人工添加解決。

2、引物

DNA聚合酶必須以一段具有3’端自由羥基(3’-OH)的RNA作為引物,才能開始合成子代DNA鏈。在體外進行DNA復制時,可以人工合成具有特定序列的寡核苷酸作為引物,該引物序列與進行擴增的目的核酸片段互補匹配,從而開始目的片段的擴增。

3、模板雙鏈的解旋

在DNA的半保留復制機制中,雙鏈DNA的解旋是在拓撲異構酶和解鏈酶的作用下完成的,該過程需要拓撲異構酶識別DNA的復制起點才能開啟,而體外擴增特定的核酸片段隻需要特異性的復制目的核酸片段,因而需要一種方式使得模板DNA解旋為單鏈DNA,之後在使之與引物結合,從而特異性的擴增目的核酸片段。

4、DNA的變性

DNA變性是指核酸雙螺旋結構中堿基對的氫鍵斷裂,使得雙鏈變為單鏈的過程。

5、DNA的復性

加熱變性的DNA在緩慢冷卻後可以由單鏈恢復為雙鏈結構,這一過程稱為DNA的復性,也稱為“退火”。當溫度降低至比變性DNA的Tm低25℃時,其復性效果最佳,越遠離此溫度,復性效果越差。因此,可以利用此特性,在加熱使模板DNA變性後,將溫度降低至特定溫度,從而使所加引物與模板DNA復性結合,進而能夠對引物所規定的核酸片段進行特異性的擴增。

6、DNA聚合酶

為瞭使模板中特定的核酸片段進行擴增,在模板與引物結合後,需要有DNA聚合酶的參與,但是由於DNA變性和復性過程的溫度較高,普通的DNA聚合酶在此過程中會由於溫度過高而失活。科學傢為瞭解決該問題,從水生棲熱菌 (Thermus Aquaticus) 中分離出瞭具有熱穩定性的DNA聚合酶,該酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活。

PCR技術的原理

PCR技術的基本原理類似於DNA的天然復制過程,其特異性依賴於靶序列連段互補的寡核苷酸引物。PCR由變性-退火-延伸三個基本反應步驟構成:①模板DNA的變性:模板DNA經加熱至93℃左右一定時間後,使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離,使之成為單鏈,以便它與引物結合,為下輪反應作準備;②模板DNA與引物的退火(復性):模板DNA經加熱變性成單鏈後,溫度降至55℃左右,引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合;③引物的延伸:DNA模板-引物結合物在72℃、DNA聚合酶(如TaqDNA聚合酶)的作用下,以dNTP為反應原料,靶序列為模板,按堿基互補配對與半保留復制原理,合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈,重復循環變性-退火-延伸三過程就可獲得更多的“半保留復制鏈”,而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。每完成一個循環需2~4分鐘,2~3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。

1、PCR反應體系:

10x擴增緩沖液;

4種dNTP混合物(終濃度);

引物(終濃度);

模板DNA;

Taq DNA聚合酶;

Mg2+;

補加雙蒸水。

2、PCR引物設計

PCR反應中有兩條引物,即5′端引物和3′引物。設計引物時以一條DNA單鏈為基準(常以信息鏈為基準),5′端引物與位於待擴增片段5′端上的一小段DNA序列相同;3′端引物與位於待擴增片段3′端的一小段DNA序列互補。

(1)引物設計的基本原則

a.引物長度:15-30bp,常用為20bp左右。

b.引物堿基:G+C含量以40-60%為宜,G+C太少擴增效果不佳,G+C 過多易出現非特異條帶。ATGC最好隨機分佈,避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列參照。

c.引物內部不應出現互補序列。

d.兩個引物之間不應存在互補序列,尤其是避免3 ′端的互補重疊。

e.引物與非特異擴增區的序列的同源性不要超過70%,引物3′末端連續8個堿基在待擴增區以外不能有完全互補序列,否則易導致非特異性擴增。

f.引物3‘端的堿基,特別是最末及倒數第二個堿基,應嚴格要求配對,最佳選擇是G和C。

g.引物的5′端可以修飾。如附加限制酶位點,引入突變位點,用生物素、熒光物質、地高辛標記,加入其它短序列,包括起始密碼子、終止密碼子等。

(2)引物設計軟件

a.Primer Premier5.0 (自動搜索)

b.vOligo6 (引物評價)

c.vVector NTI Suit

d.vDNAsis

e.vOmiga

f.vDNAstar

g.vPrimer3 (在線服務)

3、PCR反應條件

(1)預變性:

95℃,5~10min;

(2)按如下過程,進行30次循環“變性-退火-延伸”的PCR反應:

a.變性:95℃,10~30s;

b.引物退火:引物特定退火溫度,30s;

c.引物延伸:72℃,1min。

(3)PCR反應的最後延伸和終止

在最後一次反應循環結束後,應使PCR反應在72℃進一步延伸5~10min,使得未完全延伸的擴增片段全部延伸完全,以提高產物的擴增效率;然後,將反應混合物冷卻到4℃,或加入10mmol/L的EDTA終止反應。

逆轉錄PCR

PCR反應需要以雙鏈DNA作為模板,因此最初的PCR反應用於檢測目標樣本的基因組中是否存在特定的目的片段,但是這種以基因組DNA為模板的PCR反應無法檢測目的基因是否在樣本中表達,此外由於真核生物的基因中存在內含子,直接通過基因組DNA進行PCR也很難確定樣本中是否存在目的基因,針對這一問題,發展出瞭逆轉錄PCR的技術。

1、技術原理:逆轉錄PCR (reverse transcription PCR,RT-PCR)是以mRNA為模板,在逆轉錄酶作用下合成cDNA,之後再進行PCR的過程。

2、反應過程:mRNA逆轉錄合成cDNA的過程分為兩步:

在特定引物的介導下,通過逆轉錄酶的催化下以mRNA為模版合成互補的cDNA第一鏈;升高溫度使cDNA第一鏈與mRNA解離,然後降溫,使其與另一引物退火結合,並由DNA聚合酶催化延伸生成cDNA第二鏈。

3、逆轉錄反應體系

(1)RNA模板:通常20μL的逆轉錄體系,加入總RNA 1μg,如果總RNA加入過多,會導致逆轉錄不充分。

(2)引物:常用的有隨機引物和Oligo(dT)引物:隨機引物會將所有RNA分子均進行逆轉錄,此時得到的cDNA大部分來源於rRNA,主要在部分mRNA含有逆轉錄酶終止序列而難以得到其全序列時使用;Oligo(dT)與真核生物mRNA的Poly(A)區域匹配,可以特異性的對mRNA進行逆轉錄。

(3)逆轉錄酶:逆轉錄過程涉及以RNA為模板合成DNA和以DNA為模板合成互補鏈的兩個過程,目前市場上的逆轉錄酶都同時具有這些功能,因此隻需在反應體系中加入逆轉錄酶即可,而不需額外加入DNA聚合酶。

(4)4種dNTPs

https://mp.weixin.qq.com/s/8chvAefJw2nx2LxhrqtQ-A

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